1、实验材料

（1）试剂

α-MEM基础培养基、胎牛血清(BS-1102)、NEAA、L-谷氨酰胺、青链霉素、ITS、生理盐水、PBS、EGF、β-FGF等。

（2）耗材

50ml离心管、10ml移液管、1000ul枪头、 200ul枪头、T25培养瓶、眼科手术剪、镊子等。

（3）仪器设备

离心机、超净工作台、细胞计数仪、电子移液器、手动移液器等

（3）细胞来源

    脐带组织

2、实验方法

（1）溶液配置：

α-MEM完全培养基配置： α-MEM基础培养基+10% FBS+1%NEAA+1%L-谷氨酰胺+1% ITS+20 ng/ml EGF+20 ng/ml β-FGF+1%P/S。

（2）样本采集及预处理

取脐带组织置于生理盐水中，清洗血液，直至溶液清澈；

将清洗干净的脐带组织放置于无菌培养皿（100mm）中，用灭菌剪刀剪成2-3cm的小段；

用生理盐水清洗脐带小段，同时用镊子挤压脐带，挤出脐带内部残留血液，直至无血液附着在脐带表面及断口处，将清洗干净后的脐带小段浸泡于含有1%P/S的PBS中备用；

用镊子夹住脐带小段断口边缘，用剪刀沿纵向剪开脐带，可见脐带内部的三根血管，用PBS清洗剖开脐带内部的血迹；

用剪刀压住脐带小段边缘，镊子小心夹紧脐带内部表层的华氏通胶，轻轻撕下条状华氏通胶，将分离出的华氏通胶组织块浸泡于PBS清洗备用。

华氏通胶组织依次经75%乙醇（30s）、PBS（30s）、75%乙醇（30s）、PBS（1min）后，收集于50ml离心管，加入少量基础培养基，用剪刀尽可能剪碎组织，用PBS重复清洗3次。

（3）人脐带间充质干细胞分离培养

将上述剪碎组织清洗后，按照一定比例，加入T75培养瓶中，轻轻摇动平铺组织后，加入20ml α-MEM完全培养基，置于5％ CO2、37℃培养箱中培养，显微镜下观察细胞形态。

3、实验结果

（1）细胞形态

经1-2d培养观察无污染后，继续培养，毎3d对脐带组织进行半量换液，在培养10d是，镜下观察有细胞迁移出，呈短梭形、纤维样（见图1）。

                                     

图1：人脐带间充质干细胞分离10d形态，100x

持续培养15d后，人脐带间充质干细胞基本铺满T75瓶，可进行传代培养（见图2）。

                                     

图2：人脐带间充质干细胞分离15d形态，100x

4、实验结论

拟采用本公司的胎牛血清（BS-1102）可在15d从人脐带组织中分离获得原代人脐带间充质干细胞。