人外周血来源巨噬细胞扩增培养实验方法的构建

1、实验目的：构建人外周血来源巨噬细胞扩增培养的实验方法

2、实验设计：

使用含有GM-CSF的1640完全培养基分离培养外周血PBMC来源的巨噬细胞，观察细胞贴壁形态及增值状况，以构建巨噬细胞扩增培养的实验方法。

3、实验材料

（1）试剂

0.9% NaCl注射液, 1X PBS, Ficoll淋巴细胞分离液, 1640基础培养基, 胎牛血清, 100X 青链霉素, 100x ITS, Y-27632, 100x NEAA, 100x L-谷氨酰胺, 50ug GM-CSF等。

（2）耗材

一次性使用真空采血管, 50ml离心管, 10ml移液管, 1000ul枪头, 200ul枪头, T25培养瓶等。

（3）仪器设备

离心机, 超净工作台, 细胞计数仪, 电子移液器, 1000ul手动移液器, 200ul手动移液器等。

（3）细胞来源

外周血PBMC

4、实验方法

（1）溶液配置：

GM-CSF：使用移液枪吸取1ml超纯水至50ug GM-CSF中，溶解GM-CSF粉末至50ug/ml，吸取部分体积的50ug/ml GM-CSF溶液用水稀释至10ug/ml，分装为200ul/管，放置于-20℃冰箱。

RPMI-1640完全培养基配置：RPMI-1640+10% FBS+1% P/S+1x NEAA+1x L-谷氨酰胺+10 umol/L Y-27632+1x ITS+20 ng/ml GM-CSF。 

（2）样本采集及预处理

采集新鲜的外周血40mL，经75%的酒精处理后置于超净工作台中；

每10mL外周血转入50mL离心管中；

1500rpm，10min离心，收集所有血浆于50mL离心管中置于4℃备用；

3管红细胞分别加入等体积的0.9%NaCl注射液、PBS溶液、Hank ’S溶液后混匀备用；

取3个50mL离心管分别加入5mL淋巴细胞分离液，将混匀后的含有红细胞的0.9%NaCl注射液、PBS溶液、HAKS溶液分别缓慢加入含有淋巴细胞分离液的离心管中；

650g，30min，升0降0离心；

离心后从上至下依次为血浆层、白膜层、淋巴细胞分离液层、红细胞层，分别收集血浆层及白膜层置于15mL离心管中；

600g，10min离心；

收集细胞沉淀，加入0.9%NaCl注射液至10mL；

400g，10min离心；

收集细胞沉淀，分别加入1mL 1640基础培养基重悬细胞进行计数。

（3）细胞培养

使用含有GM-CSF的1640完全培养基诱导巨噬细胞形成，显微镜下观察细胞贴壁形态。

5. 实验结果

（1）细胞形态

观察含有GM-CSF的1640完全培养基中细胞贴壁形态，发现在培养5d后，细胞开始贴壁，且细胞形态接近巨噬细胞。因此，初步确定含有GM-CSF的1640完全培养基能够刺激PBMC细胞分离形成巨噬细胞。

   

5d时细胞生长形态(100X)

5d时细胞生长形态(200X)

图1 细胞生长5d时细胞贴壁形态

连续培养14d后，发现巨噬细胞逐渐增多，可判断含有GM-CSF的1640完全培养基能够促进巨噬细胞增值。

      

14d时细胞生长形态(100X)

14d时细胞生长形态(200X)

图2 细胞生长14d时细胞贴壁形态

再次对细胞进行传代，发现细胞在培养6天后，细胞分裂增值。

   

P2代细胞24h细胞生长形态(100X)

P2代细胞6d时细胞生长形态(100X)

图3 细胞传代后贴壁形态

（2）细胞数量及活率

对细胞进行了2代细胞数量及活率测定，结果如下

表1 人血液来源巨噬细胞数量及活率测定

代次	细胞数量/T25瓶	细胞活率
P1	3.21x106	88.47%
P2	6.60x106	93.66%

 

 

 

通过对细胞数量及活率测定，可看到人血液来源巨噬细胞传代培养两代后活率均可达85%以上，且细胞生长状态良好，可进行传代扩增培养。

6. 结论

采用含有GM-CSF的1640完全培养基（BS-1105）可有效从外周血PBMC来分离培养出巨噬细胞。